ANTITUMOR COMPONENTS IN THE VENOM Osmia rufa LINNAEUS, 1758 (HYMENOPTERA, APIDAE: MEGACHILIDAE)

 

Darya Khvir

junior research,  Belarusian State University,

Belarus, Minsk

 

АННОТАЦИЯ

Объектом исследования являлся яд одиночной пчелы Osmia rufa Linnaeus, 1758 который ранее не был предметом целенаправленных биохимических исследований. Белковый и пептидный состав яда изучался с использованием электрофореза в ПААГ и масс-спектрометрии. Обнаруженные противоопухолевые компоненты указывают на высокие перспективы более детального изучения яда этого насекомого с целью дальнейшего использования данных веществ в медицине, а также выявление активных иммуностимулирующих агентов.

ABSTRACT

The object of the study was the venom of a single bee, Osmia rufa Linnaeus, 1758, which had not previously been the subject of targeted biochemical studies. The protein and peptide composition of the venom was studied using SDS-electrophoresis and mass spectrometry. Detected antitumor components indicate about high prospects for a more detailed study of the venom. The final purpose - in further use of these compounds in medicine, as well as the identification of active immunostimulating agents.

 

Ключевые слова: Osmia rufa, MSI-Q-TOF, яд, белки и пептиды яда.

Keywords: Osmia rufa, MSI-Q-TOF, venoms, proteins and peptides of venom.

 

Введение

Особый практический интерес в плане получения биологически активных белков и пептидов представляют некоторые виды перепончатокрылых насекомых. Они имеют различные защитные приспособления, с помощью которых могут проявлять защиту, способную при этом вызывать аллергические реакции или сильное раздражение кожи у человека. Яды перепончатокрылых - обычно слабоподвижные, бесцветные или слабоокрашенные жидкости растворимые в воде; при высыхании образуют буроватые пластинки; в твердом состоянии сохраняют активность несколько лет [4, с 117]. Некоторые яды обладают относительно высокой токсичностью; например, для мышей ЛД50 мг/кг, в/в, составляют: 0,25 - Pogonomyrmex comanche; 0,45 - P. badius и P. rugosus; 2,5 - шершень Vespa orientalis и oca Halictus joglandis; 3,5 - обыкновенная пчела Apis mellifera; 7,2 - шмель Bombus impatiens. Хотя количество выделяемого яда невелико, даже единичные ужаления могут привести к смертельному исходу, если возникает быстро развивающаяся аллергическая реакция [7, с 113-114].

Материал и методтка

Объект данного исследования - Osmia rufa (Linnaeus, 1758) – западнопалеарктический вид с обширной территорией распространения, охватывающий Европу, Кавказ и Среднюю Азию [5, с. 201]. O. rufa является одним из немногих видов одиночных пчел, которые активны ранней весной. Эти насекомые собирают пыльцу и нектар с широкого спектра растений [8, с.195-225]. Самки строят гнезда преимущественно в различных полостях, а также легко заселяются в ульи Фабра [7, с. 93-176].

Представители данного вида известны как активные и эффективные опылители во многих регионах Палеарктики имеет широкий ареал распространения и при их одиночном образе жизни и относительно невысокой плотности они могут встречаться повсеместно в указанном регионе. Их высокая частота встречаемости предопределяет то, что они стали объектами данного исследования.

Метод получения яда был следующим. Исследуемое насекомое брали большим и указательным пальцами за брюшко и аккуратно сжимали до тех пор, пока концевые членики брюшка не раскрывались. После этого осторожно пинцетом вытягивали за жало жалящий аппарат. Ядовитая железа состояла из двух отделов: тонкого нитевидного трубчатого отдела и расширенной части-резервуара. Расширенную часть помещали на предметное стекло и выдавливали из нее яд в строго обозначенную область. Путем смывания ядовитого секрета с поверхности стекла дистиллированной водой получали 15 мкл образца яда.  К пробе добавляли по 5 мкл буфера, разделяющего гель (рН=8.8), 20 мкл лидирующего красителя (бромфенолового синего) и 20 мкл денатурирующей смеси и кипятили на водяной бане в течении 15 минут. Пробу оставляли при температуре - 18 °С до проведения электрофореза.

Денатурирующий электрофорез был использован для анализа белков и пептидов ядов исследуемого вида. Электрофорез проводили в 12,7%-й ПААГ по стандартной методике [6, с. 3]. Полученные гели промывали в дистиллированной воде, помещали на прозрачные пленки и сканировали при высоком разрешении. Анализ молекулярных масс белков и пептидов, входящих в состав ядов исследуемых насекомых проводили с использованием молекулярных стандартов. Идентификацию низкомолекулярных пептидов яда проводили с использованием масс-спектрометрии MSI-Q-TOF. Образцы загружали на 75 мкм × 250 мм, колонка Hypersilgoldc18 100x2.11.9 мм. MS/MS спектры были получены за 1 с от m/z 100-1800.

Результаты исследований

Использование метода MSI-Q-TOF позволило обнаружить в исследуемых ядах: O. rufa более 90 химических соединений с молекулярными массами от 117 до 2009 Да. На рисунке 1 представлен хроматографический профиль с масс-спектрометрическим определением состава органических соединений яда.

 

Рисунок 1. Хроматографический профиль с масс-спектрометрическим определением компонентов яда Osmia rufa

 

В зависимости от времени удержании на хроматографической колонке эти соединения элюировались на 5,0–8,5 минутах. Время удержания соединений на колонке зависело от их заряда. Было выявлено как наличие производных аминокислот, так и двух свободных – аргинина и серина. Часть соединений классифицировалась как производные карбоновых кислот, различные сложные эфиры и спирты.

Особый интерес вызывают обнаруженные компоненты, обладающие антиагиогенной активностью. К примеру, скваламин лактат, чья химическая структура представлена на рисунке 2, и который относится к классу аминостеролов. Его действие основано на блокировании мембранных ионных транспортных каналов за счет связывания с кальмодулином, препятствуя экспрессии интегринов и воздействия VEGF на соответствующие рецепторы. К настоящему времени результаты исследования относительно этого вещества не опубликованы [6].

 

Рисунок 2. Химическая структура скваламин лактата

 

Также черезвычайно неожиданным оказалось наличие в составе яда такого вещества как телратолимода, его химическая структура отображена на рисунке 3. Он является агонистом рецепторов типа 7 и 8 (TLR7/8) типа toll-like с потенциальной иммуностимулирующей и противоопухолевой активностями [7, с. 28]. При внутриопухолевом введении телратолимод связывается и активирует TLR7 и 8, стимулируя тем самым антигенпрезентирующие клетки (АРС), в том числе дендритные клетки (DC). Активация DC приводит к выработке провоспалительных цитокинов и активации иммунных ответов цитотоксических T-лимфоцитов (CTL) и B-лимфоцитов. Это может вызвать лизис опухолевых клеток. TLR7 и 8, члены семейства TLR, играют фундаментальную роль в активации иммунной системы [7, с. 31].

 

Рисунок 3. Химическая структура телратолимода

 

Выводы

Малое количество полученного яда было недостаточным для проведения экспериментов по иммунизации кроликов и получения антисывороток против них. Однако наличие вышеупомянутых компонентов указывают на высокие перспективы более детального изучения яда Osmia rufa с целью выявления активных противоопухолевых и иммуностимулирующих агентов. Исследования в данной области будут продолжены нами.

 

Список литературы:

  1. Индукция вакцинами антител и резидентных CD8 + Т-клеток усиливает защиту от SHIV-инфекции слизистой оболочки у молодых макак // JCI Insight. — — №4.
  2. Корягин, А.С. Адаптогенные свойства пчелиного яда при действии экстремальных факторов различной природы. // Вестник ННГУ им. Н.И. Лобачевского. – 2007, №3. – С. 113-115.
  3. Курченко, В.П. Физико-химические свойства биологически активных соединений из подмора пчел (Apis mellifera l.) // Природные ресурсы. – 2016. – № 2. – С. 1–6.
  4. Орлов, Б.Н. Зоотоксинология / Б.Н. Орлов, Д.Б. Гелашвили. – Москва: Высшая школа, 1985. – 280 с.
  5. Banaszak, J. and Romasenko, L., Megachilid Bees of Europe, 2nd Ed. — USA, 2001. — 289 p.
  6. Efficacy and safety of squalamine lactate eye drops in subjects with neovascular age-related macular degeneration (AMD) / [Electronic resourse]. URL:https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01678963?term=NCT01678963andrank=1. Access (Date 18.02.2019.
  7. Malyshev, S.J., “Lebensgeschichte der Osmien (Osmia) (Hymen. Apoidea) // Zool. Jb. — 1937. — №69 (2).
  8. Tasei, J.-N., Le comportement de nidification chezOsmia (Osmia) cornuta et Osmia (Osmia) rufa (L.) (Hymenoptera: Megachilidae) // Apidologie — 1973. — №4 (3).