Телефон: +7 (383)-235-94-57

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОВЕЗИКУЛ И ЭКЗОСОМ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК КРЫСЫ

Опубликовано в журнале: Биологический журнал №3(3)

Автор(ы): Деревянная Валерия Олеговна, Целуйко Сергей Семенович

Рубрика журнала: Биотех

Статус статьи: Опубликована 22 марта

DOI статьи: 10.32743/2658-6460.2019.3.3.90

Библиографическое описание

Деревянная В.О., Целуйко С.С. ВЫДЕЛЕНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ МИКРОВЕЗИКУЛ И ЭКЗОСОМ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ЭМБРИОНАЛЬНЫХ КЛЕТОК КРЫСЫ // Биологический журнал: эл.научный журнал. –2019 – №3(3). URL: https://bio-j.ru/archive/3/90 (дата обращения: 22.08.2019)

Деревянная Валерия Олеговна

студент Амурской ГМА, член Молодежного инновационного центра,

РФ, г. Благовещенск

Целуйко Сергей Семенович

проф., д-р мед. наук, проректор по научной работе Амурской ГМА,

РФ, г. Благовещенск

ISOLATION AND IDENTIFICATION MICROVESICLES AND EXOSOMES FROM EMBRRIONAL RAT`S CELL

 

Valeriya Derevyannaya

student of Amur State Medical Academy, member of Youth Innovation Centre,

Russia, Blagoveshensk

 Sergey Tseluyko

professor of Amur State Medical Academy doctor of medical science,

Russia, Blagoveshensk

 

АННОТАЦИЯ

Экзосомы - микровезикулы размером 30-180 нм, служащие для межклеточной коммуникации между всеми органами и тканями [1], имеющие двухслойную липидную оболочку и содержащие внутри себя фрагменты ДНК, белки, РНК (в том числе мРНК и микроРНК) [2, 3]. Экзосомы циркулируют в крови и продуцируются клетками в норме, но при патологии изменяется экспрессия тех или иных РНК, либо же несут в себе отличные от нормальных белки.

Целью работы являлось выделение и сканирующая электронная микроскопия экзосом и микровезикул из эмбриональных крысиных клеток с целью изучения их морфологии. Для выделения использовались эмбриональные крысиные клетки 6-го пассажа, культивируемые в стандартных условиях. Выделение производилось методом дифференциального центрифугирования, микроскопия проводилась на электронном микроскопе Hitachi s3400N.

В результате мы получили снимки сканирующей электронной микроскопии микровезикул и экзосом, необходимого размера и морфологии.

ABSTRACT

Exosomes - microvesicles with a size of 30-180 nm, which provide to intercellular communication between all organs and tissues. In this study we isolated exosomes and microvesicles from embrional rat`s cells, results were demonstrated by photographs of scanning electron microscopy to sample. In future we planning detect of exosomes by western-blot with anti-CD63 antibody.

 

Ключевые слова: экзосомы и микровезикулы, выделение экзосом, эмбриональные клетки.

Keywords: exosomes and microvesicles, exosome isolation, embrional cells.

 

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время актуальным является вопрос выделения и идентификация экзосом и микровезикул, так как их исследование проводится в лабораториях по всему миру в связи с их высокой информативной ценностью.

Изучение содержимого экзосом необходимо для продвижение таких аспектов науки и медицины, как молекулярная диагностика [5, 7] и клеточные технологии, также изучение механизмов из взаимодействия поможет выработке лечебных тактик для многих заболеваний, в патогенезе которых экзосомы играют не последнюю роль [6, 7, 8].

Например, в обзоре Shamila D. Alipoor etc. [6] представлен перечень микроРНК, содержащихся в экзосомах при заболеваниях дыхательной системы: хроническая обструктивная болезнь легких, туберкулез, бронхиальная астма, саркоидоз. Также практически при всех видах злокачественных опухолей выявлены экзосомальные РНК, которые участвуют в прогрессии опухоли, повышении выживаемости опухолевых клеток, резистентности к терапии и др. В статье Ruiz-López L etc. [9] приведены экзосомальные маркеры и РНК, ведущие к приобретению опухолью вышеперечисленных свойств. Также анализ экзосом используют для выявления свойств клеточных культур, в том числе и культур опухоли [10].

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клетки и культуральная среда

В данной работе использовались эмбриональные крысиные клетки 6-го пассажа, культивировались в стандартных условиях. Для культивирования использовалась питательная среда DMEM, 10%, фетальная тельячья сыворотка, гентамицин в концентрации 10 мг/мл, бензил-пенициллин в концентрации 100МЕ/мл.

За 24 часа до анализа экзосом была переведена на бессывороточное культивирование на среде DMEM. Конфлюэнтность культуры составляла 70%.

Изоляция экзосом и микровезикул и фиксация образцов.

Для анализа использовались 2 образца: 1 - образец кондиционированной клеточной среды, 2 - контрольный образец, содержащий вместо воды деионизированную воду. Изоляция экзосом и микровезикул была проведена про протоколу на основе [4].

  1. Среду центрифугируют 5 минут при 750 x g, 4 °C, чтобы удалить оставшиеся плавающие клетки
  2. Собирают супернатант и вновь центрифугируют 5 минут при 1,500 x g, 4 °C для уничтожения клеточного дебриса.
  3. Затем центрифугируют 35 минут при 14,000 x g, 4 °C.
  4. Супернатант убирают, а осадок ресуспендируют с 1,000 мкл PBS, после чего переносят в 1.5 мл пробирку
  5. Образец вновь центрифугируют 35 минут при 14,000 x g, 4 °C
  6. Затем удаляют супернатант

После этого для фиксации образца, осадок ресуспендируют с 300 мкл глютарового альдегида, после чего образец инкубируется на фольге в течении 12 часов на фольге, предварительно обезжиренной 95 спиртом.

Методы анализа.

В данном исследовании использовался сканирующий электронный микроскоп Hitachi s3400N. В исследовании использовалось увеличение 30,0k SE. Для микроскопии образец был последовательно дегидратирован 50% этанолом в течении 5 минут, 70% этанолом в течении 5 минут, дважды дегидратирован 95% этанолом в течении 5 минут, затем 100% этанолом в течении 10 минут. После дегидратации образец был высушен при критической точке, после чего был покрыт углеродной пылью.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

В результате мы получили снимки образцов, на первом из которых мы видим наличие микровезикул и экзосом.

 

Рисунок 1, 2. Образец №1, полученный из кондиционированной клеточной среды. На картинке мы видим округлую форму микровезикул, размером более 200 нм, а также экзосом менее 200 нм.

 

Рисунок 3, 4. Образец №2, полученный из деионизированной воды. На картинке мы не видим наличия объектов схожей морфологии и размеров

 

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной статье описывались изоляция и идентификация микровезикул и экзосом с помощью сканирующей электронной микроскопии. Мы получили изображения объектов, имеющих округлую форму и размер: более 200 нм - микровезикулы, менее 200 нм - экзосомы.

Однако необходимо окончательно констатировать наличие экзосом среди микровезикул с помощью проточной цитометрии, используя антитело CD63.

 

Список литературы:

  1. Srivastava A. Exosomes: a role for naturally occurring nanovesicles in cancer growth, diagnosis and treatment. / Srivastava A, Filant J, Moxley KM, Sood A, McMeekin S, Ramesh R // Curr Gene Ther. 2015;15(2):182-92.
  2. Pant S., Hilton H., Burczynski M. E. The multifaceted exosome: Biogenesis, role in normal and aberrant cellular function, and frontiers for pharmacological and biomarker opportunities (англ.) // Biochemical Pharmacology. — 2012. — Vol. 83, no. 11. — P. 1484—1494. — DOI:1016/j.bcp.2011.12.037. — PMID 22230477.
  3. Choi D. S., Kim D. K., Kim Y. K., Gho Y. S. Proteomics, transcriptomics, and lipidomics of exosomes and ectosomes (англ.) // Proteomics. — 2013. — Vol. 13, no. 10—11. — P. 1554—1571. — DOI:1002/pmic.201200329. — PMID 23401200.
  4. Kerstin Menck. Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood. / Kerstin Menck , Annalen Bleckmann , Matthias Schulz , Lena Ries , Claudia Binder // J Vis Exp. 2017 Jan 6;(119). doi: 10.3791/55057.
  5. Cheng. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood / L. Cheng, R. A. Sharples, B. J. Scicluna, and A. F. Hill // Journal of Extracellular Vesicles, vol. 3, 2014.
  6. Shamila D. Alipoor. Exosomes and Exosomal miRNA in Respiratory Diseases / Shamila D. Alipoor, Esmaeil Mortaz, Johan Garssen, Masoud Movassaghi, Mehdi Mirsaeidi, Ian M. Adcock // Mediators Inflamm. 2016;2016:5628404. Epub 2016 Sep 25.
  7. Mark J. McVey. Microparticles as biomarkers of lung disease: enumeration in biological fluids using lipid bilayer microspheres / Mark J. McVey, Christopher M. Spring,1 John W. Semple, Mazharul Maishan,and Wolfgang M. Kuebler // Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2016 May 1;310(9):L802-14. doi: 10.1152/ajplung.00369.2015. Epub 2016 Mar 4.
  8. A. Tickner. Functions and therapeutic roles of exosomes in cancer / J. A. Tickner, A. J. Urquhart, S.-A. Stephenson, D. J. Richard, and K. J. O’Byrne // Frontiers in Oncology, vol. 4, article 127, 2014.
  9. Ruiz-López, L., Blancas, I., Garrido, J. M., Mut-Salud, N., Moya-Jódar, M., Osuna, A., & Rodríguez-Serrano, F. (2018). The role of exosomes on colorectal cancer: A review. Journal of Gastroenterology and Hepatology, 33(4), 792–799.
  10. Théry C, Amigorena S, Raposo G, Clayton A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Curr. Protoc. Cell Biol. 2006;Chapter 3:Unit 3.22