Телефон: +7 (383)-235-94-57

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДУЛЯЦИИ ГЕПАРИНОМ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ КРЫС И МЫШЕЙ ПРИ ВНУТРИБРЮШИННОМ И ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ДАЛАРГИНА

Опубликовано в журнале: Биологический журнал №4(4)

Автор(ы): Боброва Зоя Владимировна, Пурсанов Кузьма Анастасович, Хомутов Александр Евгеньевич

Рубрика журнала: Современные науки о жизни

Статус статьи: Опубликована 22 апреля

DOI статьи: 10.32743/2658-6460.2019.4.4.108

Библиографическое описание

Боброва З.В., Пурсанов К.А., Хомутов А.Е. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МОДУЛЯЦИИ ГЕПАРИНОМ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ РЕАКЦИЙ КРЫС И МЫШЕЙ ПРИ ВНУТРИБРЮШИННОМ И ИНТРАНАЗАЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ ДАЛАРГИНА // Биологический журнал: эл.научный журнал. –2019 – №4(4). URL: https://bio-j.ru/archive/4/108 (дата обращения: 12.11.2019). DOI: 10.32743/2658-6460.2019.4.4.108

Боброва Зоя Владимировна

аспирант ННГУ,

РФ, г. Нижний Новгород

Пурсанов Кузьма Анастасович

канд. мед. наук, доц. ПИМУ,

РФ, г. Нижний Новгород

Хомутов Александр Евгеньевич

д-р биол. наук, проф. ННГУ,

РФ, г. Нижний Новгород

 

COMPARATIVE CHARACTERISTIC OF THE MODULATION OF HEPARIUM BEHAVIORAL REACTIONS OF RATS AND MICE WITH INTRAINBREATED AND INTRANASAL INTRODUCTION DALARGINA

 

Zoya Bobrova

postgraduate Student, UNN,

Russia, Nizhny Novgorod

Kuz'ma Pursanov

Ph.D., dotsent PIMU,

Russia, Nizhny Novgorod

Aleksandr Khomutov

D.Sс.N., Professor UNN,

Russia, Nizhny Novgorod

 

АННОТАЦИЯ

Сравнительная характеристика внутрибрюшинного и интраназального введений показала, что гепарин при внутрибрюшинном введении потенцирует горизонтальную и вертикальную активность, а также увеличивает количество возвратов с периферии в центр в тесте «открытое поле». При интраназальном введении количество поведенческих актов не выходит за границы контрольных величин.

ABSTRACT

Comparative characteristics of intraperitoneal and intranasal introductions showed that Heparin, when administered by intraperitoneal injection potentiates horizontal and vertical activity as well as increases the number of returns from the periphery to the centre in the "Open field" test. When administered intranasally, the number of behaviour action don't exceed the control values.

 

Ключевые слова: даларгин, гепарин, внутрибрюшинное и интраназальное введение, тест «открытое поле».

Keywords: dalargin, heparin intraperitoneal and intranasal introductions? the "Open field" test.

 

Пептидергическая система регуляции физиологических функций является сложным иерархическим комплексом, в котором каждая функция регулируется как правило множеством регуляторных пептидов (РП). Вычленение таких пептидных констелляций позволяет с одной стороны, провести анализ структурно-функциональных закономерностей, а с другой стороны, даёт теоретическое обоснование для применения комплексов РП и их аналогов в качестве терапевтических средств. В частности, основанием для применения могут быть патологические состояния, в которых особую роль играет увеличение тревожности [3].

Даларгин, являясь агонистом опиоидных рецепторов, имеет высокую аффинность к δ-рецепторам и меньшую к μ-рецепторам. Наибольшая концентрация δ-рецепторов наблюдается в лимбической системе мозга [2]. Доказано, что корково-лимбико-ретикулярные связи лежат в основе эмоционального поведения, и нейрохимические механизмы этих связей опосредуются через энкефалины [7]. Таким образом, даларгин, проникая через гематоэнцефалический барьер, может оказывать влияние на поведенческий статус животного.

Работа была выполнена на 30 лабораторных мышах массой 18-20 г и на 24 беспородных крысах-самцах массой 180-200 г, содержащихся на общем рационе вивария. В экспериментах использовали: даларгин (Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Ley-Arg) – оригинальный гексапептид, аналог лей-энкефалина, синтезирован в Институте экспериментальной кардиологии ВКНЦ РАМН; высокомолекулярный гепарин производства Московского эндокринного завода, содержащий 5000 МЕ/мл (1МЕ=0,0077 мг); протамина сульфат, содержит в 1 мл 10 мг сухого вещества, являющийся классическим блокатором эндогенного гепарина; налоксон - антагонист опиатных рецепторов.

В экспериментах использовали два вида введений: внутрибрюшинное и интраназальное. При интраназальном введении раствор наносился микропипеткой в виде капли на гидрофобную поверхность (восковая пластинка). Экспериментальное животное, фиксированное в специальном устройстве, «снюхивало» эту каплю с поверхности пластинки [6].

При изучении поведенческих реакций в тесте «открытое поле» животное помещалось в центр белой квадратной платформы 1.5´1.5 м с пластиковым полом, расчерченной на квадраты равной площади (6´6 см). В течение пяти минут визуально регистрировали: горизонтальную двигательную активность (количество пересеченных секторов); вертикальную активность (количество подъемов на задние лапки); количество возвратов с периферии в центр (кол-во повторно пересечённых квадратов).

Статистическая обработка экспериментальных данных была выполнена с помощью программы «Биостат». Для сравнения нескольких групп использовали однофакторный дисперсионный анализ и критерий Стьюдента для множественных сравнений.

При внутрибрюшинном введении даларгина мышам в дозе 0.5 мг/кг (тестовая доза) через 15 мин горизонтальная активность, вертикальная активность и количество возвратов с периферии достоверно увеличивается относительно контрольных величин на 125, 371 и 363% соответственно (табл.1).

Таблица 1.

Влияние даларгина, гепарина, протамин сульфата и налоксона на поведенческую активность мышей при внутрибрюшинном введении

Условия

эксперимента

Кол-во поведенческих реакций / 2 мин

Горизонтальная активность

Вертикальная активность

Кол-во возвратов с периферии

Физиол. р-р контроль)

45.6±2.8 100%

2.4±0.9 100%

7.0±1.4 100%

Даларгин (0.5 мг/кг)

57.2±4.9* 125%

8.9±1.8* 371%

25.4±3.5* 363%

Гепарин (50 МЕ/кг)

68.4±5.2* 150%

7.8±2.1* 325%

29.5±3.1* 421%

Гепарин(50 МЕ/кг) →Даларгин (0.5 мг/кг)

67.5±4.6* 148%

9.8±1.5* 408%

25.7±3.4* 367%

Протамин (10мг/кг)→ Даларгин (0.5 мг/кг)

31.7±4.7*+ 70%

5.5±1.8* 230%

17.0±2.8*+ 243%

Налоксон (1.0мг/кг)→ Даларгин (0.5 мг/кг)

25.3±1.8*+ 55%

2.2±1.0+ 92%

5.3±1.7+ 76%

* - Различия между контрольными и экспериментальными данными статистически значимы (р≤0.05)

+ - Различия между серией «даларгин» и экспериментальными данными статистически значимы (р≤0.05)

Верхний ряд – количество поведенческих актов.

Нижний ряд – процент от контроля.

 

Гепарин и даларгин на фоне действия гепарина в дозе 50 МЕ/кг достоверно отличаются от контроля и недостоверно от серии, в которой вводили только аналог лей-энкефалина [10]. Блокада эндогенного гепарина протамин сульфатом сопровождается снижением показателей горизонтальной, вертикальной активности и возврата с периферии относительно серии, в которой вводили только даларгин, однако показатели вертикальной активности и возврата с периферии были достоверно выше контрольных величин (табл. 1).

Общеизвестно, что даларгин является опиоидным пептидом, а значит при его введении показатели поведенческих реакций должны снижаться, что и происходит при введении по схеме налоксон (1.0мг/кг)→ даларгин (0.5 мг/кг). Предварительное введение налоксона снижает показатель горизонтальной активности до 55%, показатель вертикальной активности до 92% и количество возвратов с периферии до 76% относительно контрольной серии (табл.1).

При интраназальном введении крысам тестовой дозы даларгина горизонтальная активность увеличивается на 156%, вертикальная активность на 197%, количество возвратов с периферии на 184% относительно контрольных величин (табл.2).

Таблица 2.

Влияние даларгина и гепарина на поведенческую активность крыс при интраназальном введении

Условия

эксперимента

Кол-во поведенческих реакций / 2 мин

Горизонтальная активность

Вертикальная активность

Кол-во возвратов с периферии

Физиол. р-р контроль)

170.4±18.2 100%

36.5±4.7 100%

37.2±2.7 100%

Даларгин (0.5 мг/кг)

265.8±12.4* 156%

71.8±5.5* 197%

68.4±3.6* 184%

Гепарин (50 МЕ/кг)

162.9±12.8+ 96%

32.6±4.9+ 89%

31.7±3.0+ 85%

Гепарин(50 МЕ/кг) →

Даларгин (0.5 мг/кг)

170.0±7.3+ 100%

30,7±5.2+ 82%

38.1±4.1+ 102%

* - Различия между контрольными и экспериментальными данными статистически значимы (р≤0.05);

+ - Различия между серией «даларгин» и экспериментальными данными статистически значимы (р≤0.05).

Верхний ряд – количество поведенческих актов.

Нижний ряд – процент от контроля.

 

При интразальном введении гепарина и последовательном применении исследуемых веществ по схеме гепарин → даларгин были получены данные достоверно не отличающиеся от контрольных величин, в то время как относительно серии с введением только даларгина полученные показатели поведенческих реакций были достоверно ниже (табл.2).

Принципиальное значение имеет путь введения. Эффект пептидов может резко различаться при периферических и центральных путях введения. Экспериментально показано [8], что наиболее эффективными являются внутрижелудочковый и внутривенный пути введения нейропептидов. Но следует учитывать высокую травматичность при данных путях введения, делающих их невозмож­ными для клинического применения. Мало адекватными для пепти­дов является пероральный (вследствие разрушения их эндопептидазами желудочно-кишечного тракта), внутривенный (т.к. период нахождения пептидов в крови составляет менее 30 минут). Согласно литературным данным [1], выраженные эффекты наблюдаются при интраназальном введении пептидов, в частности семакса, окситоцина, вазопрессина. Поэтому более эффективным считается интраназальный путь введения, так как пептиды при попадании на слизистую оболочку носа по периневральным и сосудистым пространствам попадают в ликвор, минуя гематоэнцефалический барьер.

Сопоставляя данные об изменении поведения лабораторных крыс в тесте «открытое поле» при внутрибрюшинном и интраназальном введении можно предположить, что даларгин способен вызывать изменение поведенческого статуса животных той же направленности, что и при внутрибрюшинном введении.

Механизм проникновения соединений через обонятельный эпителий остается малопонятным. В проникновении некоторых соединений (белки, нейропептиды, медиаторы) при интраназальном введении могут участвовать механизмы быстрого аксонального транспорта, реализуемые в волокнах обонятельного нерва [6]. Такой вид транспорта давно открыт и изучен для аминокислот в периферической обонятельной системе, т.е. между обонятельными рецепторами и обонятельными луковицами. Возможен транспорт соединений через сосуды респираторного эпителия [16]. Но экспериментальные данные [4,6] свидетельствуют о том, что опережающее накопление идет в обонятельных луковицах.

Введение даларгина на фоне с гепарином не вызывало достоверных изменений двигательной активности и эмоционального статуса животных. Это позволяет предположить, что гепарин при совместном введении с опиоидным пептидом блокирует нейротропным эффект даларгина.

Характер модуляции гепарином эффектов регуляторных пептидов может быть различным [16]. Полагают, что гепарин может способствовать или, наоборот, препятствовать взаимодействию пептидов с рецепторами [11]. Например, при блокаде свободного гепарина протамин сульфатом не проявляется действие лютеинизирующего гормона на увеличение массы яичников, эффект гормона проявляется только при наличии в циркуляции активного гепарина [11]. Это же характерно для некоторых эффектов АКТГ, инсулина, факторов роста [9,11,15]. Также существует вероятность, что эффекты гепарина реализуются через опиоидные рецепторы [8]. Указанные авторы выявили позитивное влияние регулярно вводимых низких доз гепарина (64 МЕ/кг) на обучаемость в тесте восьмилучевого радиального лабиринта и, обсуждая возможный механизм обнаруженного феномена, указывают на опиоидподобное действие гепарина.

Одним из возможного объяснения отсутствия нейротропного эффекта даларгина на фоне совместного введения с гепарином при интраназальном введении, является нарушение процесса интернализации. Так как рецепторы регуляторных пептидов на плазматических мембранах клеток расположены не гомогенно, а образуют кластеры, ассоциированные с гликокаликсом, в большинстве случаев комплексы пептид-рецептор кластеризуются в специализированных областях плазматической мембраны – так называемых покрытых, или окаймленных ямках. Покрытые клатрином (белком, фиксирующим рецепторы) окаймленные ямки являются стабильными элементами, связаны с плазматическими мембранами и претерпевают морфологические изменения в процессе пиноцитоза и эндоцитоза. После связывания и кластерирования лигандов в окаймленные ямки начинается температурный и энергозависимый процесс закрытия шейки этой ямки [14]. При этом слияния мембран в области шейки на этой стадии не происходит. Следующая стадия связана с образованием эндосом, которые затем отрываются от окаймленной ямки и направляются либо в комплекс Гольджи, либо сливается с лизосомами. Вторичные лизосомы, образующиеся в результате этого слияния, содержат внутри мембраны, рецептор и ферменты родительских первичных лизосом. Вместе с этим пептид может претерпевать только частичную деградацию в функционально модифицированной лизосоме. После этого пептид и его биологически активный фрагмент высвобождается из лизосомы и может теперь взаимодействовать с различными компонентами цитоплазмы или с ядром [12,13]. В обонятельном эпителии присутствуют также многочисленные компоненты с фосфатными группами [5], возможно, участвующие в процессе интернализации. При этом в процесс обоняния вовлекаются фосфатазы, гидролазы и киназы, связанные с мембранами клеток, и приводящие к фосфорилированию и конформационным изменениям, как в рецепторных молекулах, так и в ионных каналах [5]. Можно предположить, что гепарин, ингибируя активность киназ, нарушает процессы интернализации обонятельных рецепторов и блокирует нейротропный эффект даларгина.

 

Список литературы:

  1. Ашмарин И.П., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е. Модуляция гемостатических реакций in vitro и in vivo представителями семейств регуляторых петидов// Весн. РАМH. - 1996. - № 6. - С. 50-57.
  2. Ашмарин И.П., Ляпина Л.А., Пасторова В.Е., Кудряшов Б.А. Действие регуляторных пептидов с различной биологической активностью на процессы полимеризации фибрина и неферментативный фибринолиз// Вопр. мед. химии. - 1991. - Т. 37. - № 1. - С. 85-86.
  3. Базян А.С. Физиологическая роль аутоадренорецепторов. - М.: Медицина, 1991. - 158 с.
  4. Гладышева О.С., Бодрова Л.Г. Сравнительное исследование фосфолипидного состава обонятельного эпителия крысы и мыши // Сенсорные системы. - 2002. - №2. - С. 170-173.
  5. Гладышева О.С., Ганшин В.М., Зинкевич Э.П. Молекулярные механизмы обонятельной рецепции позвоночных и возможная роль фосфатаз // Сенсорные системы. - 2003. - №4. - С. 259-274.
  6. Гладышева О.С., Троицкая В.Т. Интраназальное введение ГАМК: влияние на внутривидовую агрессию самцов мышей// Сенсорные системы. - 2000. - №2. - С. 99-102.
  7. Казаков В.Н., Кравцов П.Я., Андреева В.Ф. Роль опиатных пептидов в регуляции различных форм эмоционального поведения// Физиологическое и клиническое значение регуляторных пептидов. - Пущино, 1990. - С. 75.
  8. Кондашевская М.В. Роль гепарина в иммунных, воспалительных и репаративных процессах // Клиническая и экспериментальная морфология. – 2012. – С. 64-70.
  9. Кудряшов Б. А., Ляпина Л.А., Азиева Л.Д. Комплексное соединение гепарина с гистамином, его физико-химические и биологические свойства// Вопр. мед. химии. - 1990. - Т.36. - № 4. - С. 55 –57.
  10. Хомутов А.Е., Пурсанов К.А., Лушникова О.В. Сенсибилизация гепарином опиоидных рецепторов, инициированных даларгином // MEDICUS. International medical scientific journal. - 2017. - № 2(14). - С. 17-20.
  11. Шапиро Ф. Б., Умарова Б.А., Струкова С.М. Гормональная регуляция секреции гепарина тучными клетками крыс при стрессорных воздействиях// Рос. физиол. журн. им. И. М. Сеченова. - 1998. - Т. 84. - №5. - С. 469–473.
  12. Benovik J.L., Stone W.C., Caron M.G. Inhibition of the adrenergic receptor kinase by polyanions// J. Biol. Chem. - 1998. - N.264. - P. 6707-6710.
  13. Hasbi A., Polastron J., Allouche S. Neurochem. Internalization and recycling of-opioid receptor are dependent on a phosphorylation-dephosphorylation mechanism// J. Neurochem. - 2000. - Vol. 293. - N 1. - P. 273-247
  14. Jin W., Lee N.M., Loh H.H., Thayer S.A. Opioids mobilize calcium from inositol 1,4,5-triphosphate-sensitive stores in NG 108-15 cells// J. Neurosci. - 1994. – N. 14. - P.1920-1929.
  15. Schumacher B., Haberstroh J., Pecher P. The stimulation of neo-angiogenesis in the ischemic heart by the human growth factor FGF//J. Cardiovasc. Surg. (Torino). - 1998. - Vol. 39. - N 4. - P. 445-453.
  16. Weisz P. B., Joullie M.M., Hunter C.M. A basic compositional requirement of agents having heparin-like cell-modulating activities//Biochem. Pharmacol. - 1997. - Vol. 54. – N. 1. - P. 149-157.