Телефон: +7 (383)-235-94-57

ОПТИМИЗАЦИЯ КРИОПРОТЕКТОРОВ ДЛЯ ЛИОФИЛИЗАЦИИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ SALMONELLA

Опубликовано в журнале: Биологический журнал №5(5)

Автор(ы): Котлов Сергей Алексеевич

Рубрика журнала: Микробиология

Статус статьи: Опубликована 22 июня

DOI статьи: 10.32743/2658-6460.2019.5.5.124

Библиографическое описание

Котлов С.А. ОПТИМИЗАЦИЯ КРИОПРОТЕКТОРОВ ДЛЯ ЛИОФИЛИЗАЦИИ ВАКЦИННЫХ ШТАММОВ SALMONELLA // Биологический журнал: эл.научный журнал. –2019 – №5(5). URL: https://bio-j.ru/archive/5/124 (дата обращения: 12.11.2019). DOI: 10.32743/2658-6460.2019.5.5.124

Котлов Сергей Алексеевич

бакалавр химических наук, мл. науч. сотр., Институт Тонких Химических Технологий,

РФ, г. Москва

 

OPTIMIZATION OF CRYOPROTECTANTS FOR LYOPHILIZATION OF SALMONELLA VACCINE STRAIN

 

Sergey Kotlov

bachelor of Science, research assistant, Moscow State University of Fine Chemical Technologies,

Russia, Moscow

 

АННОТАЦИЯ

В настоящее время для производства препаратов живых вакцин Salmonella является важным сохранение стабильности биологических свойств при длительном хранении. Наиболее распространенным способом стабилизации бактериальных культур является лиофилизация. Исследования показывают, что для минимизации гибели клеток и для увеличения срока хранения препаратов состав криопротектора для каждого отдельного вида бактерий должен подбираться индивидуально и включать в себя сбалансированный качественно и количественно набор компонентов. Для повышения выживаемости штаммов Salmonella при лиофилизации были изучены и оптимизированы два типа криопротекторов – глицерин-основные и желатин-сахарозные. При использовании данных оптимизированных протекторов выживаемость вакцинных штаммов Salmonella достигла значения более 70%.

ABSTRACT

Nowadays the important task of Salmonella live vaccine production is a preservation of biological properties stability at archiving and long-term storing. The worldwide popular method of stabilization of bacterial cultures is a freeze-drying (lyophilization). The researches show that composition of cryoprotectants must be individually engineered for every bacterial kind and must contain quantitatively and qualitatively balanced components. By the aim of advance of Salmonella strain’s survival after lyophilization, two types of cryoprotectant, glycerol-based and gelatin-sucrose, were researched and optimized. By dint of using these optimized cryoprotectants the higher percent of survival live vaccine Salmonella was reached (over 70%).

 

Ключевые слова: лиофилизация, Salmonella, криопротектор, хранение бактериальных штаммов.

Keywords: lyophilization, freeze-drying, Salmonella, cryoprotectant, storing bacterial strains.

 

Основными средствами борьбы с сальмонеллезами является использование противосальмонеллезных вакцин. Актуальным является вопрос сохранения стабильности биологических свойств аттенуированных штаммов сальмонелл при получении вакцинных препаратов. В настоящее время лиофилизация является одним из самых экономичных и эффективных способов длительного хранения бактерий. В процессе лиофилизации вода испаряется в условиях вакуума без оттаивания льда, что позволяет полностью сохранить первичную структуру биоматериала. Полученный продукт предельно быстро и легко растворяется. Высушенные клетки сохраняются до 15 лет [6], если защитить их от воздействия кислорода, влаги и света.

Следует отметить, что на выживаемость культур после лиофилизации влияет несколько параметров, среди которых наиболее значимыми являются концентрация клеток в образце биоматериала, состав защитной среды (криопротектора) и объемное соотношение протектора и лиофилизируемого образца. Следует отметить, что сальмонеллы считаются стойкими к лиофилизации, процент их выживаемости после лиофильной сушки обычно составляет до 60%.

Жизнеспособность сальмонелл после лиофилизации значительно повышается, если исходная концентрация клеток в суспензии высокая – 109-1010кл/мл. Уплотненные суспензии клеток имеют более высокий процент выживания, чем разбавленные, т.к. лизированные клетки и клеточные вещества могут выполнять криозащитную роль [8]. Установлено, что наибольший выход биомассы при глубинном культивировании вакцинного штамма сальмонеллы достигается при аэрации и добавлении глюкозы.

Использование вспомогательных веществ может способствовать уменьшению некоторых нежелательных эффектов. Вспомогательные вещества являются инертными веществами, такими, как, сахара. Сахара, проникая в клетку и создавая там осмотическое давление, препятствуют образованию кристаллов льда и разрушению клетки в процессе замораживания. Наиболее важными являются буферные растворы, использующиеся для контроля pH криопротектора, и стабилизаторы, использующиеся для защиты от пересушивания, такие, как глюкоза или сахароза.

Наибольшее влияние на выживаемость культуры после высушивания оказывает защитная среда (криопротектор). Основной задачей криопротектора является защита биоматериала и обеспечение мелкопористой и достаточно плотной структуры после удаления воды. Наиболее востребованными веществами в составе криопротекторов для бактерии являются глицерин, сахароза, маннит, желатин, агар-агар, лошадиная сыворотка крови и молоко.

В нашей работе исследовалось влияние защитных сред на основе лошадиной сыворотки крови, а также глицерина и желатина на выживаемость сальмонелл в процессе лиофилизации.

Материалы и методы

В качестве тест культуры использовали коммерческий штамм Salmonella typhimurium TA-100 (далее S.th.TA-100) из бактериальной тестовой системы исследования мутагенеза. Музейный штамм культуры хранится в морозильной камере при температуре минус 80°С в растворе 10% глицерина. Все работы с бактериальной культурой проводили в стерильных условиях в микробиологическом ламинарном шкафу II класса защиты (БМБII, Ламинар-С). Бактериальную культуру получали из ночной культуры разбавлением и инкубированием в течении 3 часов в шейкер при температуре 37°С и 180 об/мин . После достижения оптической плотности бактериальной суспензией 1,5 D (при длине волны 600 нм) биомасса центрифугировалась в стерильных пробирках на протяжении 30 минут при 4°С со скоростью 4000 об/мин. Осадок ресуспензировали с криопротектором в заданных соотношениях и переносили в криопробирки. Бактериальную культуру с криопротектором подвергали градиентной заморозке со скоростью 1-2°С в минуту до температуры -80°С.

Лиофилизацию бактериальных культур проводили с помощью лиофильной сушки Alpha 1-2 LD plus (Martin Christ, Германия). Для этого криопробирки закрывали стерильной бумагой и помещали в рабочую камеру лиофильной сушки. Высушивание проводили при температуре конденсора -50°С и остаточном давлении в камере 1 мбар. Продолжительность сушки составляла 36 часов до остаточной влажности 3-4 %.

Для исследования выживаемости лиофилизированной культуры проводили ее реактивацию. Для этого лиофилизованную культуру переводили в суспензию сразу после вскрытия криопробирок, добавляя в каждую 2-3 мл питательной среды. Реактивируемую суспензию выдерживали 30 минут при комнатной температуре для полного восстановления высушенных клеток.

Количество жизнеспособных микроорганизмов определяли чашечным методом Коха. Для этого проводили серию десятикратных разведений препарата, полученного после реактивации. Степень разведения образцов для высева на агаризованную среду зависила от количества КОЕ в одной дозе исследуемого препарата. В случае с исследуемым штаммом эта серия разведений составляла10-6, 10-7, 10-8. Из каждой пробирки отбирали аликвоту суспензии и высевали на агаризованную питательную среду в чашках Петри после чего герметизированные чашки помещали в термостат на 24 часа при температуре 37°С. На следующий день производили учет результатов. Для этого проводили подсчет выросших на чашках Петри колоний и вычисляли содержание живых бактерий в исходной пробирке с клеточной реактивированной суспензией.

Результаты и обсуждение

Исследование лиофилизации сальмонелл с глицерин-основными криопротекторами

Протекторы на основе глицерина с добавлением непроникающих протекторов, а также с использованием вспомогательных веществ, в частности сахарозы, являются наиболее изученными защитными средами для бактерий. В качестве криопротектора его применяют в концентрациях 10-20%. Увеличение концентрации свыше 30% приводит к снижению выживаемости бактерий [5].

Нами была проведена серия опытов с разными составами криопротекторов на основе глицерина. Для контроля pH в протекторы вводился однократный фосфатно-солевой буферный раствор (ФСБР). На первом этапе тестировались протекторы с разным процентным содержанием глицерина (Таблица 1).

Таблица 1.

Выживаемость сальмонелл после лиофилизации при применении глицерина в качестве криопротектора

п/п

Состав защитной среды

Кол-во жизнеспособных клеток после лиофилизации, КОЕ/мг*109

Выживаемость клеток при лиофилизации, %

1

5% глицерина в ФСБР

0,51 ± 0,06

50,49 ± 5,94

2

10% глицерина в ФСБР

0,56 ± 0,03

55,45 ± 2,97

3

15% глицерина в ФСБР

0,41 ± 0,03

40,59 ± 2,97

4

20% глицерина в ФСБР

0,23 ± 0,01

22,77 ± 0,99

 

Оптимальные результаты были выявлены у протекторов, содержащих не более 15% глицерина, дальнейшее увеличение его концентрации существенно снижало выживаемость сальмонелл.  В дальнейшем проверялись модификации глицерин-основных протекторов с добавлением сахарозы и маннита в разном процентном соотношении (таблица 2).

Таблица 2.

Выживаемость сальмонелл после лиофилизации при применении глицерина и сахарозы в качестве криопротектора

№ п/п

Состав защитной среды

Кол-во жизнеспособных клеток после лиофилизации, КОЕ/мг*109

Выживаемость клеток при лиофилизации, %

1

10% глицерина, 10% сахарозы в ФСБР

0,31 ± 0,02

31,31 ± 2,02

2

10% глицерина, 15% сахарозы в ФСБР

0,25 ± 0.03

25,24 ± 3,03

3

20% глицерина, 5% сахарозы в ФСБР

0,23 ± 0,02

23,23 ± 2,02

 

В случае защитной среды с сахарозой не был выявлен достаточный процент выживаемости сальмонелл. Маннит, напротив, демонстрирует прирост в выживаемости сальмонелл в синергии с глицерином (таблица 3).

Таблица 3.

Выживаемость сальмонелл после лиофилизации при применении глицерина и маннита в качестве криопротектора

№ п/п

Состав защитной среды

Кол-во жизнеспособных клеток после лиофилизации, КОЕ/мг*109

Выживаемость клеток при лиофилизации, %

1

5% глицерина,

5% маннита в ФСБР

0,62 ± 0,03

61,37 ± 2,97

2

10% глицерина,

5% маннита в ФСБР

0,78 ± 0,08

77,22 ± 7,92

3

5% глицерина,

10% маннита в ФСБР

0,50 ± 0,03

49,50 ± 2,97

4

5% маннита в ФСБР

0,12 ± 0,03

11,88 ± 2,97

5

10% маннита в ФСБР

0,21 ± 0,02

20,79 ± 1.98

 

При использовании протектора с 10% содержанием глицерина и 5% содержанием маннита выживаемость сальмонелл достигает 75%.

Исследование лиофилизации сальмонелл с желатин-сахарозными криопротекторами

Среды, в которых в качестве коллоида вводится желатин и агар-агар, нашли широкое применение при производстве сухих живых вакцин, так как они лишены антигенных свойств. Одной из наиболее распространенных защитных сред является среда Файбича [Файбич М.М., 1968], существующая в двух модификациях: сахарозо-желатиновая (сахароза 10%, желатин 1-1,5%) и сахарозо-желатиновая с агар-агаром (сахароза 10%, желатин 1-1,5%, агар-агар 0,05-0,2%. В последующем М.М. Файбич рекомендовал добавлять в эти среды антиоксиданты: 1% аскорбиновой кислоты или 1 % тиомочевины. Эти добавки увеличивают стабилизирующее действие среды и позволяют хранить высушенные культуры без создания вакуума. Коллоидные компоненты этой защитной среды не проникают в клетку, но заставляют клеточную оболочку плотнее прилегать к цитоплазме, что важно при размораживании [Куплетская М.Б. и др., 2011]. Указывается, что добавление 0,5% раствора хлорида натрия в защитную среду обеспечит лучшее сохранение производственных штаммов сальмонелл в процессе сублимационной сушки [Е.В.Светлакова, 2003]

Нами также исследовались протекторы на основе среды Файбича для лиофилизации сальмонелл. При использовании составов среды Файбича, взятого из литературных источников, средний процент выживаемости сальмонелл составлял не более 45%, что значительно уступало результатам лиофилизации с глицерин-основными защитными средами. В дальнейшем были испытаны криопротекторы, являющиеся модификацией составов среды Файбича, с добавлением гидрофосфатов калия и хлорида натрия (таблица 4).

Таблица 4.

Выживаемость сальмонелл после лиофилизации при применении сахарозно-желатиновой защитной среды*

№ п/п

Защитная среда

Кол-во жизнеспособных клеток после лиофилизации, КОЕ/мг*109

Выживаемость клеток при лиофилизации, %

1

ЖС

0,49 ± 0,03

38,28 ± 2,34

2

ЖС в ФСБР

0,47 ± 0,04

36,72 ± 3,13

3

ЖСТ

0,48 ± 0,04

37,50 ± 3,13

4

ЖСТ в ФСБР

0,60 ± 0,05

46,84 ± 3,91

5

ЖСА

0,51 ± 0,03

39,84 ± 2,34

6

ЖСТА

0,57 ± 0,05

44,53 ± 3,91

7

ЖСТ+

K2HPO4+KH2PO4

0,61 ± 0,02

47,66 ± 1,56

8

ЖСТ+ NaCl

0,83 ± 0,11

64,84 ± 8,59

9

ЖСТ в ФСБР + NaCl

0,81 ± 0,03

63,28 ± 2,34

0

ЖСТА + NaCl

0,82 ± 0,04

64,06 ± 3,13

* Ж – желатин (0,5 %); С – сахароза (10 %); А – агар-агар (0,1 %); Т - тиомочевина (0,5 %); K2HPO4 (0,5 %); KH2PO4 (0,17 %); NaCl (0,5 %).

 

Процент выживаемости сальмонелл по сравнению с немодифицированным протектором Файбича вырос и составил более 60%, что позволяет считать желатин-основные криопротекторы подходящими для лиофилизации вакцинных штаммов сальмонелл.

Заключение

В ходе работы были протестированы криопротекторы для лиофилизации сальмонелл на основе глицерина и маннита, а также желатина. Найдены оптимальные концентрации, позволяющие достичь выживаемости клеток при лиофильной сушке свыше 70%.

Высокий процент выживаемости (60%) имеют протекторы на основе желатина и сахарозы. Из-за специфики протектора возникают трудности с смывом сальмонелл с питательной среды. Также высушенный биоматериал имеет достаточно плотную структуру, затрудняющую дальнейшую работу, что, однако, частично нивелируется за счет добавления в протектор 0,5% хлорида натрия, обеспечивающего более пористую структуру лиофилизата.

Наибольший процент выживаемости (более 70%) достигается при использовании глицерин-основного протектора с 10% содержанием глицерина и 5% содержанием маннита. В качестве основного недостатка следует выделить необходимость контроля pH протектора с помощью буферных растворов.

 

Список литературы:

  1. H. Crowe, L. M. Crowe, A. E. Oliver, et al., // Cryobiology,2001, - p.43, 89 – 105.
  2. Vincourt, L. Nguyen, J-C. Chaumeil, and G. Dumortier, // Cryobiology, 2001, - p. 60, 262 – 270.
  3. Sinskey T.J., Silverman G.J/, Goldblith S.A. Influence of Platen Temperatures and Relative humidity during storage on the survival of freeze-dried Salmonella typhimurium. //Applied microbiology. Jan. 1967. P. 22-30. Vol. 15. № 3.
  4. Кузьмина О.М. Конструирование защитных сред для криозамораживания молочнокислых бактерий//Научное обеспечение молочной промышленности (ВНИМИ-80 лет): Сборник научных трудов. – М.: ВНИМИ, 2009. –с. 228-232.
  5. Кузьмина О.М. Исследование влияния состава защитной среды на эффективность процесса криозамораживания микроорганизмов. 2010. Москва. /Диссертация/.
  6. Охапкина В.Ю. Методы поддержания микробных культур. Часть 2. Лиофилизация. Журнал «Теоретическая и прикладная экология». 2009. № 4.
  7. Похиленко В.Д., Баранов А.М., Детушев К.В. Методы длительного хранения коллекционных культур микроорганизмов и тенденции развития. //Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Медицинские науки. 2009.№ 4 (12). С. 99-121.
  8. Шендеров Б.А., Гахова Э.Н., Манвелова М.А., Пиорунский Д.А., Карнаухов В.И. Способ длительного хранения естественных симбиотических ассоциаций микроорганизмов человека и животных. /Патент РФ №2123044 10.12.1998/.
  9. Ярцев М.Я., Раевский А.А., Анисимова Л.В., Павленко И.В., Александрова М.Л. Способ изготовления вакцины против сальмонеллеза сельскохозяйственных животных. /Патент РФ № 2129016 20.04.1999/.